پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:
- نخست رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتریها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.
- پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکسهایی مینمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری میشود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده میشوند .
مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار میگیرد سپس با آب مورد شستشو قرار میگیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایههای پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایهها وغشا میگردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست میدهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایهٔ پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمیشود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
- در انتها سطح فروتی راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه میپوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد. دراین مرحله باکتریهای بی رنگ (باکتری های گرم منفی) به رنگ قرمز درمیآیند وباکتریهای بنفش (باکتری های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی میمانند .
با تشکر از توضیحات کامل شما