3 کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
از میان تکنیک های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا می شود. علت این رشد را می توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیکGC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند، نسبت داد.
3-1 فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد قطبیت فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن < اترها < استرها < کتونها < آلدئیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• درصد خلوص بالا ( حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا ، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد.)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون ( به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می شود)
• واکنش پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطابق با آشکارساز
3-2 اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می شود:
1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
2- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیتها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان میدهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک ، فاصله بین پیک ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می شود که در ستون هایی با قطر مرسوم (کمتر از 5mm) سرعت جریان نباید بالاتر از 2/5 ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می شود.
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلالها در ازای یک حلال خالص میتواند بهکار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت ) ( Gradient گفته می شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می یابد.
3- تزریق کننده(Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم افزار ) می دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می شود. در روش دستی، از سرنگ هایی با ظرفیت های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه بردار ( Loop )بستگی دارد و مقدار آن معمولا در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می شود.