-1- فیتوشیمی[1]
فیتوشیمی شاخه ای از علم است که از نظر محتوا بین جداسازی ترکیبات طبیعی بیوشیمی گیاهی و همچنین فارماکوگنوزی
[2] قرار داشته به بررسی تغییرات موجود در سیستمهای گیاهی جهت تولید متابولیت های ثانویه با خواص دارویی در طول زندگی گیاه و در طول مدت انبارشدن آن می پردازد. در حقیقت فیتوشیمی شامل بررسی تعداد متنوع و زیادی از ترکیبات طبیعی بوده که توسط گیاهان تولید و ذخیره می گردد و رابطه مستقیمی با ساختمان شیمیایی این مواد، بیوسنتز، انتشار طبیعی و فعالیت بیولوژیکی آنها دارد که بحث و بررسی این فراوردههای بیولوژیکی نیاز به آگاهی از روش های مناسب برای جداسازی، خالص سازی، شناسایی مواد متشکله موجود در گیاهان دارد. تكنيكهاي رايج دراين علم عبارتند از: استخراج و جداسازي، تغليظ، آناليز و تكنيكهاي كروماتوگرافي و الكتروفورز
[3]كه در نهايت شناخت فرمول هاي دقيق ساختاري و مسيرهاي بيوسنتزي را امكان پذير مي سازد. پیشرفت در فیتوشیمی مستلزم استفاده از روشهای موجود و ابداع و تکمیل روشهای تازه می باشد از ویژگیها و نقاط قوت این علم انجام مطالعات علمی برروی مقادیر کمی از مواد اولیه می باشد. شواهد فيتوشيميايي از جمله شواهد و صفات مورد استفاده در طبقه بنديهاي فيلوژنتيكي
[4] هستند، به گونه اي كه در گونههاي داراي قرابت و خويشاوندي با يكديگر، تركيبات مشابهي يافت مي شود اما هميشه نيز اين گونه نيست. استفاده از روشهای متنوع فیتوشیمیایی در زمینه تجزیه مواد گیاهی، کشاورزی، صنایع غذایی و دارویی و به طور کلی در زمینه های متفاوت علوم و تکنولوژی می باشد ]1[.
1-1-1- بررسی فیتوشیمی یک گیاه:
مراحل بررسی فیتوشیمی یک گیاه به شرح زیر می باشد:
- عصاره گیری ( استخراج) مواد گیاهی
- جداسازی و تفکیک اندام مورد نظر
- شناسایی ترکیبات تفکیک شده
- مطالعه بر روی مسیرهای بیوسنتز ترکیب ویژه
- ارزیابی های کمی ]2[
1-1-1-1- استخراج مواد گیاهی
قبل از این که یک ترکیب شیمیایی مورد بررسی قرار گیرد باید آن ترکیب به صورت خالص تهیه شود زیرا در غیر این صورت نمی توان به درستی ساختمان شیمیایی ترکیب و همچنین به بیوسنتز و متابولیسم و اثر بیولوژیک آن مواد پی برد، در نتیجه روش های استخراج برای دست یابی به مواد خالص بسیار حائز اهمیت میباشد.
برای استخراج مواد از دو نوع نمونه گیاهی استفاده می شود:
- استخراج مواد از گیاه خشک شده
- استخراج مواد از گیاه تازه
برای انجام آزمایشات بر روی گیاهان اکثراً از گیاه خشک شده استفاده میشود. مزیتهای گیاه خشک شده عبارتاند از :
- كاهش وزن محصولات گیاهی؛ (گیاهان مختلف بین 60 تا 90 درصد آب دارند در نتیجه خشك كردن باعث كاهش چشمگیر وزن و سهولت در حمل و نقل می شود.)
- غیر فعال شدن آنزیمهای گیاهی و جلوگیری از تغییرات آنزیمی مواد موثره گیاه.
- غیر فعال شدن باكتریها و قارچها و جلوگیری از فساد گیاه.
- یکسان بودن شرایط برای تکرار آزمایش ؛ (نمونه تازه برای انجام تکرار آزمایش به خاطر محدودیتها در زمان و مکان همیشه در دسترس نیست، اما نمونه خشک شده همیشه در دسترس می باشد.)
در مجموع كاهش رطوبت باعث پایداری در گیاهان جمع آوری شده میشود.
باید دقت داشت گیاه نمونه در شرایط استاندارد وکنترل شده خشک شده باشد، بهترین روش برای خشک کردن گیاه، خشک کردن در جریان هوا و به دور از تابش مستقیم نور خورشید می باشد. باید توجه کرد که عملیات خشک کردن، سریع و بدون استفاده از حرارت زیاد صورت گیرد. برای انجام عملیات خشک کردن، گیاه باید عاری از بیماریهای گیاهی ( ویروسی، باکتریایی، قارچی ) باشد ]3[.
در روش استخراج مواد از گیاه خشک شده ابتدا آن را پودر می کنند تا سطح تماس بیشتری با حلال داشته باشد سپس با روش های مختلف و به کمک حلال های مختلف استخراج را انجام می دهند ]4[.
.
1-1-1-1-1- روش های استخراج
روش استخراجی که انتخاب می شود به دو عامل بستگی دارد:
- مقدار آب موجود در نمونه (بیشتر در استخراج مواد از گیاه تازه مطرح است)
- نوع ماده جدا شدنی(یعنی چه ماده ای قرار است از گیاه استخراج شود آیا حلال در آب است ویا محلول در حلال های آلی وغیر قطبی، و...)
روش های استخراج عبارتند از:
- ماسراسیون[5]: روش خیساندن مکرر همراه با تکان دادن؛ گیاه پودر شده را در دمای اتاق درون حلال قرار داده و بعد از حدودا چهار روز، آن را از کاغذ صافی عبور داده و عصاره را تغلیظ میکنند. این کار را با دو یا سه بار تکرار انجام می دهند. به دلیل اینکه در دمای پایین امکان خروج بهینه مواد به حلال وجود ندارد با تکرار و طولانی کردن زمان خیساندن انتقال مواد را به حلال زیاد می کنند. مزیت این روش این است که ساختار مواد موجود در گیاه از بین نمیرود.
- سوکسله[6]: روش عصاره گیری مداوم است که در حضور حرارت انجام می گیرد بنابراین احتمال تجزیه بخشی از مواد شیمیایی موجود در گیاه که دمای جوش آن ها در زیر نقطه جوش حلال است وجود دارد (معایب) ولی به دلیل حرارت، جنبش مولکولی بالا رفته و بنابراین فرایند انتقال غیر فعال (حرکت از محیط پرغلظت گیاهی به محیط کم غلظت حلال) تسریع شده و همچنین به دلیل بالا بودن تعداد دفعات استخراج، فرایند استخراج بهتر صورت می گیرد.
- پرکولاسیون[7]: در ظرفی به نام پرکولاتور[8] انجام می شود.
- روش های ویژه مانند فلورنج[9]: برای استخراج روغن های فرار
- روش های فراصوت[10] ]5[
1-1-1-1-2- ترتیب استفاده از حلال
برای استخراج ابتدا از حلالهای غیر قطبی (غیر پلار) استفاده میکنند تا مواد محلول در چربی را استخراج کنند مانند پترولیم اتر و کلروفرم و در انتها از حلال های قطبی مانند الکل و اتیل استات استخراج را انجام میدهند. قابل توجه است که در بین عملیات استخراج هم از حلالهایی نسبت به موارد ذکرشده دارای قطبیت بینابینیاند استفاده میشود. مثلاً میتواند به ترتیب زیر باشد:
- کلروفرم (حلال غیر پلار): برای جدا کردن چربی ها و ترپنوئیدها
- اتیل استات
- متانول (حلال پلار): جدا کردن ترکیبات پلار مانند فنول ها] 6[
1-1-1-1-3- تغلیظ عصاره
بعد از این که اندام گیاهی با حلال های مختلف به ترتیبی که ذکر شد عصاره گیری شدند نوبت به جدا کردن حلال ها از عصاره های مذکورمی شود که این عمل را تغلیظ گویند. با حرارت دادن می توان حلال ها را به صورت بخار از عصاره جدا کرد برای جلو گیری از اتلاف انرژی و جلوگیری از خطرات ناشی از دمای زیاد و همچنین جلوگیری از بهم خوردن ترکیبات حاصله، از دستگاه های تقطیر در خلاء مانند روتاری استفاده می شود (با این روش می توان در دمای 30-40 درجه حلال ها را از عصاره اصلی جدا کرد) ]7[.
برای نگهداری عصاره آن را در یخچال نگهداری می کنند و برای جلو گیری از کپک زدن مقداری تولوئن (جهت جلوگیری از رشد قارچ ها) به آن اضافه می کنند.
[1] Phytochemistry
[2] Pharmacognosy
[3] Electrophoresis
[4] Phylogenetic
[5] Maceration
[6] Soxhlet
[7] Percolation
[8] Percolator
[9] Phlorange
[10] Ultrasound
-1-1-2- کروماتوگرافی
یکی از تکنیک های رایج خالص سازی مواد موجود در عصاره کروماتوگرافی می باشد که اساس برهم کنش ترکیب بین دو فاز؛ ثابت و متحرک می باشد. انتخاب روش کروماتوگرافی به نوع ترکیبی که قرار است جداسازی شود و همچنین آگاهی به ترکیبات مشابه موجود در عصاره بستگی دارد، زیرا تشابه ساختمانی ترکیبات در یک عصاره کار جداسازی را خیلی سخت کرده و به این منظور باید در انتخاب روش دقت زیادی شود]8[.
برای انتخاب نوع کروماتوگرافی باید موارد ذیل را مورد توجه قرار داد؛
1- حلالیت جسم؛ برای مثال عصاره متانولی؛ برای جدا کردن ترکیبات محلول در آب مانند قند ها و اسید آمینه یا عصاره کلروفرمی؛ برای جدا کردن ترکیبات محلول در چربی مانند چربی ها و استروئید ها.
2- فراریت جسم ( نقطه ی جوش جسم فراریت جسم را نشان می دهد)؛ برای اجسام فرار مثل اسیدهای چرب، ترپن ها، اسانس ها و.. ]9.[
1-1-1-2-1- روش های کروماتوگرافی
از جمله روشهای کروماتوگرافی میتوان به موارد زیر اشاره کرد؛
1- کروماتوگرافی ستونی
در این نوع کروماتوگرافی جسم بین فازهاى مایع و جامد پخش می شود. فاز ساکن جسم جامدی است که اجزای مایعی را که از آن می گذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب می کند و آنها را جدا میکند. برای جدا کردن یک ترکیب با کروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر می کنند و کمی از نمونه مایع را روی آن می گذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب می شود، سپس حلال استخراج کننده ای را در داخل ستون جریان می دهند. این فاز مایع متحرک، ترکیبات را براساس حلالیت مختلف به مرور در خود حل می کند و بدین ترتیب اجزای مخلوط را با خود میبرد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط می توانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند. ترکیبی که با نیروی کمتری جذب فاز ساکن شود سریعتر خارج میشود. به هر بخش خارج شده از ستون اصطلاحاً فرکشن
[1] گویند. یکی از مهمترین مزایای آن در مواردی که مقدار زیادی از جسم (درحد گرم) نیاز باشد، بهترین روش کروماتوگرافی ستونی می باشد ]10[.
2- کروماتوگرافی لایه نازک
[2] (TLC)
کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد ( سیلیکاژل) را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش می کنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه می گذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در تانک قرار می دهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد. وقتی که حلال از صفحه بالا می رود ممکن است یکی از ترکیبات موجود در عصاره حلالیتش با حلال بیشتر باشد و از عصاره جدا شده و با حلال بالا برود بر اساس همین مکانیسم ترکیبات گوناگون جدا شده و لکه های مختلفی را روی صفحه ایجاد می کنند. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال صفحه قرار می گیرند. کروماتوگرافی درTLC به صورت بالا رونده در داخل تانک انجام می شود.
مزایای TLC :
سرعت بالا، حساسیت بالا ( در حد میکروگرم می توان جسم را جدا کرد) و کاربرد در موارد گوناگون از مزیت های دیگر این روش می باشد ]11[.
مراحل کار و آماده کردن صفحه TLC
الف- چربی زدایی صفحات شیشه ای با استون ب- تهیه سوسپانسیون سیلیکاژل ج- کشیدن سوسپانسیون روی صفحات و اجازه دادن برای خشک شدن د- فعال کردن در آون 100-110 درجه به مدت 30 دقیقه ]12[.
3- کروماتوگرافی ستونی با سفادکس
[3]
4- الکتروفورز
[4]: روش جدا سازی مواد بر اساس بار الکتریکی
5- کروماتوگرافی کاغذی(PC)
6- کروماتوگرافی گازی(GC)
7- فیلتراسیون ژلی
8- کروماتوگرافی HPLC
1-1-1-3- روشهای تشخیص ساختمان شیمیایی ترکیبات خالص شده
در ابتدا باید خلوص ماده جدا شده ثابت شود. برای اثبات خلوص راه های زیر وجود دارد:
1- تعیین نقطه ذوب
2- تعیین نقطه جوش
3- قدرت چرخش نور پلاریزه (وقتی که نور پلاریزه یا همان تک رنگ (دارای یک طول موج) به ترکیبات فعال نوری بتابد نور را به یک سمت منحرف می کند )
4- وجود یک لکه در کروماتوگرام با سیستم حلال های مختلف
5- استفاده از روش های بیوشیمیایی و رنگ سنجی
در مرحله بعد ساختار مولکولی تعیین می شود ]26-13 .[برای تعیین ساختار مولکولی به روش طیف سنجی چهار روش موثر استفاده می شود؛
- طیف ماورای بنفش (UV)
- طیف مادون قرمز (IR)
- طیف رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR)
اسپکترومتری جرمی (MS)
[1] Fraction
[2] Thin layer Chromatography
[3] Sephadex
[4] Electrophoresis