اطلاعيه

Collapse
No announcement yet.

جداسازی موکور يا رايزوموکور مولد آسپارتيک پروتئاز آنزيم های منعقدکننده شير

Collapse
X
 
  • فیلتر
  • زمان
  • نمایش
Clear All
new posts

    جداسازی موکور يا رايزوموکور مولد آسپارتيک پروتئاز آنزيم های منعقدکننده شير

    آنزيم هاي انعقادي شير از منابع مختلفي تهيه مي شوند که مهمترين وقديمي ترين آن مايه پنير (رنت) مي باشد که با منشا حيواني است . اما به دليل کاهش ميزان توليد آن سعي شده از جايگزين هاي ميکروبي ٬گياهي وطيور استفاده شود . که اين جايگزين ها بايد داراي پروتئاز اسيدي باشند .
    در شيرخام پروتئاز هايي نيز حضور دارند که داراي فعاليت آنزيمي پاييني هستند که البته در انعقاد نقشي ندارند زيرا سبب هيدروليز Bکازئين به گاما کازئين مي شوند . اما برخي باکتري هاي گرم منفي سايکروتروف گونه هايي از سودوموناس ٬ آلکاليجنس و فلاووباکترييوم در شير خام حضور دارند که با پروتئاز هاي خود سبب هيدروليز کازئين به ترکيبات پارا کاپا کازئين مانند و انعقاد مي شوند.
    اساس انعقاد آنزيمي شير به حساسيت کاپا کازئين و حضور يون کلسيم بستگي دارد .پس از شکسته شدن کاپا کازئين در حضور آنزيم و به هم ريختن ساختار آن ميسل ها تجمع کرده ودر هم فرو مي روند و تشکيل دلمه مي دهند و انعقاد رخ مي دهد.

    انعقاد شير

    انعقاد شير عبارت از تجمع ميسلهاي آن به صورت يک شبکه است.اين شبکه نمايانگر فاز جامد مي باشد .شير در روشهاي متداول پنير سازي٬ با افزودن آنزيم هاي ويژه اي دلمه مي شود.
    ماده پروتئيني عمده شير موسوم به کازئينوژن به صورت لخته تشکيل مي گردد . انعقاد شير به صورت پنير به وسيله ي عمل اسيد حاصل از تخمير لاکتوز به واسطه ي باکتري ها يا به وسيله ي مايه پنير به دست آمده از معده چهارم نشخوارکنندگان شير خوار و يا هر دو توأم با يکديگر صورت مي گيرد . اثر منعقد کننده ي پنير مايه مربوط به آنزيم رنين است که پروتئين شير را منعقد مي کند و آن را به صورت لخته مي سازد .
    در غالب موارد با اين که براي انعقاد شير مايه پنير به کار مي برند ، مقداري باکتري نيز به منظور توليد اسيد و کمک به تشکيل لخته ي پنير اضافه مي کنند ، به علاوه از باکتري هاي توليد کننده بوي خوش و يا باکتري هاي توليد کننده گاز نيز استفاده مي شود .
    پروتئازها نسبت به آنزيم هاي ديگر براي کنترل انعقاد شير ترجيح داده مي شوند. پروتئازهاي موجود در پنير مايه که در انعقاد شير دخيل مي باشند وباعث تشکيل لخته در پنير سازي مي شوند
    شامل:کيموزين٬پپسين وپروتئازهاي ميکروبي بوده وعموما براي توليد پنيرهاي مختلف کاربرد دارند.
    ميزان کيموزين تحت تاثير تغذيه دام قرار مي گيرد.ميزان کيموزين از عصاره استخراج شده 75 تا 100 درصد متغير مي باشد وهمچنين ميزان پپسين از عصاره استخراج شده حداقل 30 درصد مي باشد لذا رنت شامل دو ترکيب کيموزين وپپسين مي باشدکه در گوساله تازه متولد شده (calf) نسبت کيموزين به پپسين 95 درصد به5درصد مي باشد .

    انواع آنزيم هاي منعقد کننده شير:

    1-آنزيم هاي حيواني مانند: رنين٬کيموزين٬پپسين٬تريپسي ن٬کيموتريپسين
    2-آنزيم هاي گياهي مانند: پاپائين٬فيسين٬بروملين
    3-آنزيم هاي ميکروبي مانند: باکتريها و قارچهاي سنتز کننده آنزيم
    4-پروتئازهاي طبيعي شير ( قليايي يا پلاسمي – اسيد ي)


    1-آنزيم هاي حيواني:

    رنين (Rennin) :

    شکل خالص آنزيم موجود در رنت (Rennet) يا مايه پنير است که در پنير سازي از آن استفاده مي شود همانطور که اشاره شد اين آنزيم از معده چهارم گوساله شير خوار استخراج مي گردد.پس از اينکه گوساله شروع به مصرف علف مي کند به جاي رنين پپسين ترشح مي شود.
    در روش سنتي شيردان يا معده چهارم گوساله جوان را خشک کرده ونمک مي زنند وسپس آن را به ذرات کوچک بريده وعصاره آنزيمي را به وسيله محلول نمک 10درصد استخراج کرده وسپس با اضافه کردن اسيد٬PH آن را تنظيم کرده و سپس با افزودن نمک(16-20درصد)ومواد نگهدارنده٬رنين را صاف مي کنند.اغلب کارامل براي استاندارد کردن رنگ وگهگاهي نيز مواد طعم دهنده براي پوشش بوهاي تند حاصل از معده استفاده مي شود. اين آنزيم به صورت پودرهاي هيدراته٬گرانول و يا مايع عرضه مي شود.

    مکانيزم عمل رنين:

    اين آنزيم به حالت غير فعال به نام پرورنين(Prorennin) ترشح مي گردد.ماده استخراج شده از معده خشک شده ٬ هم داراي رنين وهم داراي پرو رنين مي باشد.تبديل پرورنين به رنين با افزودن اسيد تسريع مي گردد.اين فرايند به صورت اتوکاتاليتيک است٬يعني با توليد مقداري رنين ٬اين ماد ه بقيه پرورنين را به رنين فعال تبديل مي کند.پپسين نيز مي تواند کار تبديل پرورنين به رنين را انجام دهد.عمل تبديل پرورنين به رنين همراه با آزاد شدن پپتيدهايي از قسمت انتهاي N ملکول پرورنين مي باشد که طي آن وزن مولکولي از 36000 به 31000 کاهش مي يابد.
    سه پيوند دي سولفيد قسمتهاي مختلف پرورنين را به هم متصل مي کنند که بعد از تبديل به رنين نيز بدون تغيير باقي مي مانند.PH مناسب براي فعاليت رنين 3.5 است اما بيشترين پايداري آن در PH =5 مشاهده ميشود.

    کيموزين:

    حساسيت به هيدروليز در حضور آنزيم کيموزين يا لخته دادن به وسيله کلسيم از جمله خواص کازئين به شمار مي رود.کيموزين به باند پپتيدي بين فنيل آلانين 105 ومتيونين 106 واقع در کاپا کازئين به سرعت حمله ور شده ٬ آن راهيدروليز مي کند در نتيجه کاپا کازئين قدرت تثبيت کنندگي خود را در قبال ممانعت ازرسوب ميسلهاي کازئين از دست داده ٬ ميسلها در حضور کلسيم متراکم مي شوند.
    کيموزين از منابع ميکروبي نيز به دست مي آيد.
    کيموزين استحصالي از اشرشياکلاي در سال 1990 ميلادي در آمريکا مهمترين نوع مايه پنير محسوب مي شده است.همچنين کيموزين استحصالي ازKluyeromyces lactic دربعضي از کشور هاي اروپايي نظير آلمان ٬دانمارک ٬پرتقال براي پنيرسازي استفاده مي شود.


    پپسين:

    اين آنزيم به صورت غير فعال موسوم به پپسينوژن در مخاط پوششي سطح معده توليد مي گردد که در PH پايين معده با جداشدن پپتيد هاي کوچک از قسمت انتهاي Nمولکول به پپسين فعال تبديل مي گردد.پپسين از321 اسيد آمينه تشکيل شده است .پپسين در PH بيشتر از 5 دناتوره مي شود وفعاليت خود را از دست مي دهد.اين آنزيم ترجيها اتصالات مجاور فنيل آلانين٬تيروزين وتريپتوفان را مي شکند.اين پروتئاز که در PH پايين واسيدي عمل مي کند در توليد پنير استفاده مي شود اما کيفيت پنير توليدي به خوبي پنير توليد شده توسط رنين نيست چراکه امکان توليد پپتيد هاي تلخ مزه وجود دارد.
    تلخي حاصله را مي توان با به کار گيري کربن فعال٬آنزيم کربوکسي پپتيداز A ويا اولترافيلتراسيون کاهش داد ويا حذف نمود .
    پپسين طيور:
    پپسين طيور مي تواند پروتئين شير را در PH اسيذي منعقد نمايد. چنانچه ميزان کشتار طيور در کشتارگاه ها خيلي زياد باشد جايگزيني پپسين طيور به جاي مايه پنير رنين مقرون به صرفه است.


    ترپسين وکيمو تريپسين :

    اين دو آنزيم از پانکراس در روده ترشح مي شوند .تريپسين پيوند پپتيدي تشکيل شده توسط گروه کربوکسيل اسيد آمينه ليزين يا آرژنين با ساير اسيدهاي آمينه را مي شکند . کيمو تريپسين در واقع شامل چندين نوع آنزيم شبيه به هم است که با پيشوند آلفا٬بتا٬گاما٬دلتا وپي مشخص مي شوند.اينها پيوند مجاور اسيد هاي آمينه تيروزين ٬فنيل آلانين و تريپتوفان را مي شکنند وPH مناسب براي فعاليت آنها حدود8 است.


    2-آنزيم هاي گياهي:

    اين آنزيمها داراي ريشه گياهي هستند.محل فعال اين آنزيمها داراي يک سيستئين ويک هيستيدين است که براي فعاليت آنها ضروري مي باشد.
    به عنوان مثال پرتئازهاي گياهي به کار گرفته شده براي توليد پنير در نواحي مختلف جهان شامل پاپائين ٬بروملين ٬فيسين٬اوريزاسين (Oryzasin) از گياه (Oriza sativa)٬کاکاميسين (Cucumisin) از (Cucumis melo ssp) ٬پروتئازسيب فاسد شده از(Calotropis) وپروتئازکاهو از(Lactuca sativa) استحصال مي شود. دانه گياه علفي Solanum dubium fresen که بومي سودان است٬ توانايي انعقاد شير رابه خاطر حضور پروتئاز هاي سريني پايدار دارد.

    فيسين:

    فيسين (Ficin) از شيره سفيدرنگ يا لاتکس درخت انجير(Ficus Carica) تهيه مي شو. فيسين مي تواند پروتئين هاي شير رادر PH7 الي 8 کواگوله نمايد.

    پاپائين:

    پاپائين (Papain)که از خربزه درختي (Carica Papaya) که ٬کاملا رسيده نباشد ٬به دست مي آيد . اين آنزيم در PH 7-4 ودرجه حرارت 70-40 درجه سانتيگراد فعال مي باشد.

    بروملين:

    بروملين (Bromelain) که از آناناس (Ananas Comosus) استحصال مي شود . قدرت انعقادي اين مايه پنير در مقايسه با فيسين و پاپائين بسيار ناچيز است.


    معايب آنزيم هاي گياهي منعقد کننده شير:

    در پنير توليد شده توسط اين نوع از آنزيم ها طعم ومزه تلخ ايجاد مي شود.
    راندمان توليد پنير در مقايسه با مايه پنير حيواني کاهش مي يابد.
    کيفيت پنير توليد شده از لحاظ ارگانولپتيکي کاهش مي يابد.



    3-آنزيم هاي ميکروبي:

    مايه پنير هاي ميکروبي (microbial rennet) پس از جنگ جها ني دوم مصرف آن در پنير سازي به سرعت افزايش يافته که از قارچ هاي Mucor Miehei وMucor Pusilus و Endothia parasitica استخراج وبه صورت تجارتي عرضه مي شوند.
    آنزيم هاي ميکروبي انعقاد شير به طور مطلوب جايگزين مايه پنير هاي حيواني در صنعت پنير سازي شده اند. آسپرژيلوس اوريزه (Aspergillus oryzae) ازبين 16 نژاد قارچ براي توليد بيشترين فعاليت انعقادي شير٬ انتخاب شده است .
    از باکتري هاي توليد کننده آنزيم هاي منعقد کننده شير مي توان به استرپتوکوکسيهاي مزوفيل٬نظير استرپتوکوکوس لاکتيس واسترپتوکوکوس کرموريس اشاره کرد .اما به دليل خاصيت پروتئوليتيکي نسبتا پايين اينها ٬توصيه مي شود ازاسترپتوکوکوس فکاليس واسترپتوکوکوس دورانس استفاده شود.همچنين از محيط کشتهاي ويژه اي بدين منظور استفاده ميشود مثلا فعاليت قابل توجه آنزيم حاصل از باسيلوس سوبتيليس زماني فراهم ميشود که باکتري در محيط کشتي با پايه نمکي در PH=6 ودرجه حرارت 37 درجه سانتي گراد با شيک کردن rpm 175 در طي يک روز ٬ کشت داده شود .
    اين باکتري ها در مقايسه با استرپتوکوکسي هاي لاکتيس و کرموريس ٬ از حداکثر دماي رشد بالاتري برخوردارمي باشند (بيش از 45 درجه سانتيگراد).


    - پروتئازهاي طبيعي شير:

    آنزيم هاي طبيعي يا به طور طبيعي در شير خام وجود دارنديا از برخي از باکتري هاي سرمادوست که به ميزان زيادي پروتئينازهاي فعال توليد مي کنند ناشي مي شود . Auclair و Lenoir در سال 1980 خاطر نشان کردند که سرد مردن شير خام سبب انتقال پروتئيناز قليايي ( پلاسمين) از فاز کلوئيدي به فاز سرمي مي شود. بتا کازئين در دماي پايين ممکن است به دو جزء گاما کازئين و پروتئوزپپتون هيدروليز شود اين دو بعد ها در حضور پروتئينازهاي ديگر به پپتيدهاي تلخ تبديل شده مزه اي تلخ به شير مي دهند در نتيجه راندمان پنير در اثر اين تبديل پايين مي آيد .



    مکانيزم انعقاد به وسيله مايه پنير:

    کازئين:
    کازئين شير حدود75تا85 درصد پروتئين شير را کازئين تشکيل مي دهد .معمولا کازئين به صورت خالص درشير موجود نيست بلکه ابتدا به صورت کازئينات کلسيم است وسپس با جذب فسفات کلسيم فسفوکازئينات کلسيم تشکيل مي شود که شبيه دانه هاي تمشک است در پروتئين کازئين حدود 20 اسيد آمينه شرکت دارند .اندازه کازئين حدود 20-10 ميلي ميکرون است وحرارت هاي پايين اصولا تاثيري روي کازئين ندارد حرارت از 130 درجه سلسيوس بالاتر روي کازئين اثر مي گذارد وممکن است تغييراتي در بافت پروتئيني کازئين به وجود آورد کازئين به 4قسمت تقسيم مي شود( آلفا1،آلفا2)،بتا،کاپاوگاما که به نسبت هاي متفاوتي در کازئين شير وجود دارندکاپا کازئين را فاکتورپايدارکننده(STABILIZING FACTOR)گويند ،زيرا موجب مي شود ميسل ها در شير به صورت معلق درآيند ورسوب نکنند ،اگر کاپا کازئين راجداکنند حالت پايدار از بين مي رود وپروتئين کازئين در کنار يون کلسيم رسوب مي کندماده اي به نام رنين مي تواند کاپا کازئين را از شير بيرون بکشد ،اگر يون کلسيم در شير نباشد حتي اگر کاپا کازئين بيرون کشيده شود رسوب نمي کند. 10-7درصد رنين داخل شير مي ريزند وتا دماي 50-42 درجه سلسيوس حرارت ميدهند شير رسوب ميکند (لخته رنيني تشکيل مي شود) ،انعقاد شير توسط اسيدهم انجام مي شود PHشير 6/6-4/6 است لخته اي که توسط اسيد به وجود مي آيد اسيد –کازئين ولخته اي که توسط رنين به وجود مي آيد رنين -کازئين است لخته رنين-کازئين بهتر است چون کلسيم وفسفر بالا تري نسبت به لخته اسيد-کازئين دارد بهترين اسيد براي ايجاد لخته ،لاکتيک اسيد است)درمورد رنين براي ايجاد لخته حتما يون کلسيم را نياز داريم ولي در مورد اسيد يون کلسيم را نياز نداريم (از آبليمو ،سرکه و.......)نيز مي توان استفاده پس از جداشدن کازئين آنچه مي ماند آب پنير است (whey protein)اين مايع که پس از رسوب دادن کازئين وصاف کردن آن به دست مي آيد حاوي گلوبولين ها ،لاکتوفرينها ،سرولوآلبومين ،ايميونوگلوبينها ،پروتئوپپتوفرکشن ولاکتو فرين مي باشد لاکتوفرين از پروتئينهاي آهن دار است پروتئينهاي بالا برخلاف کازئين به حرارت حساسند واگر دمااز60درجه سلسيوس بالاتر رود رسوب مي کنند ولي در مقابل اسيد و رنين مقاومند.

    -انعقاد شير توسط مايه پنير در دو مرحله انجام مي شود:

    در مرحله اول که آنزيمي است آنزيم روي کاپا- کازئين که داراي 169 اسيد آمينه مي باشد اثر مي کند و پيوند ميان فنيل آلانين و متيونين را که به ترتيب اسيدهاي آمينه شماره 105 و 106 در اين پروتئين هستند مي شکند در نتيجه کاپا- کازئين به دو بخش کازئينو- ماکروپپتيد محلول وپارا کاپا کازئين نامحلول شکسته مي شود .به دنبال اين اثر حفاظت کننده کاپا – کازيين روي s α- کازئين ازبين مي رود.
    اين واکنش آنزيمي حتي ممکن است در درجه حرارت 5درجه سانتيگراد نيز اتفاق افتد.
    در مرحله دوم که غير آنزيمي است٬کازئين تغيير يافته تحت اثر يون کلسيم رسوب ميکند.ساير آنزيمهاي تجزيه کننده پروتئين٬نظير پپسين و پروتئازهاي ميکروبي نيز مي توانند همان پيوند ذکر شده را بشکنند.
    انعقاد شير با افزودن آنزيم هاي منعقد کننده٬ تنها در حضور يون کلسيم عملي مي گردد.



    -نتيجه گيري:

    ٭تفاوت کلي بين آنزيم هاي حيواني و گياهي منعقد کننده شير اينست که مايه پنير هاي حيواني حاوي 8- 4 درصد پروتئازهاي فعال وناخالصي هايي نظير ماده لزج و نمک مي باشد.اما مايه پنير هاي ميکروبي حاوي 80- 90 درصد پروتئازفعال است.
    ٭عصاره هاي گياهي در مقادير زياد سبب پروتئوليز شديد وايجاد طعم تلخ مي شوند ولي مقادير پايين آن محصولي با کيفيت بالا مي دهد .

    ٭ منعقده کنندهاي گياهي در مقايسه با کيموزين زمان تشکيل ژل کوتاهتري دارند.
    * فعاليت ضعيف پروتئيناز در شير پاستوريزه يا پنير عملا هيچ اهميتي ندارد ٬ با اين وجود نگهداري شيرUHT به مدت طولاني در دماي اتاق منجر به آن مي شود که آنزيم فوق محصول را لخته و طعم تلخي به آن مي دهد.

    مراحل انجام آزمايش:

    · جداسازي رايزو موکور ياموکور مولد آسپارتيک پروتئاز

    از آنجايي که کپکهاي خانواده موکوراسه از عوامل شايع فساد مواد غذايي گياهي هستند،ازيک عدد خيار در حال فساد نمونه گرفتيم وبا رنگ لاکتو فنل کاتن بلو رنگ آميزي کرديم.
    زيرميکروسکوپ هيف هاي بدون ديواره عرضي که از آنها اسپورانژيوفورهاي منتهي به اسپورانژيوم منشعب شده،مشاهده شد.
    سپس نمونه مورد نظر رابصورت نقطه اي در محيطSDAکشت داديم.
    سپس در دماي 30 درجه به مدت 48تا72 ساعت انکوبه شد.
    پس از اين مدت کلني هاي سفيد پرزي که تمام پليت راپر کرده اند مشاهده شد.
    دوباره نمونه اي ازپليت را بارنگ لاکتو فنل کاتن بلو رنگ آميزي کرديم وپس از اطمينان از مطابقت نمونه زير ميکروسکوپ با خانواده موکوراسه از نمونه کشت خالص تهيه کرديم.

    · برسي فعاليت پروتئازي

    براي اين منظور نمونه خالص شده رايزو موکور را درمحلول آبي skim milk تلقيح کرديم وبه مدت 72ساعت در30درجه نگهداري شد.
    پس از اين مدت در شير لخته مشاهده شد که نشان دهنده پروتئاز مثبت بودن نمونه رايزو موکور است.
    ضمنا براي ارزيابي تواناييMOمورد نظر درتوليد اسيد پروتئاز هر 24 ساعت محيط داخل انکوباتور را از نظر لخته شدن شير بررسي کرديم.


    · توليد آسپارتيک پروتئاز

    سويه مولد آسپارتيک پروتئاز رابصورت آگار شيبدار کشت داده ودر 30درجه سانتي گراد انکوبه کرديم.
    پس از مشاهده رشد کافي محتويات لوله را درml10آب مقطر استريل ريخته وشديدا بهم زديم.
    سپس در ارلنml500حاويml100 محيط کشت توليد اسيد پروتئازٍ،ml5از سوسپانسيون تهيه شده ريختيم ودر 30درجه سانتي گرادباسرعت هم زنrpm200 به مدت 4روز انکوبه کرديم.
    سپس محتويات ارلن،10 دقيقه در rpm4000 سانتريفوژشد.
    پس از رسوب ميسليوم ها به اندازه 0.55 حجم مايع رويي،سولفات آمونيوم وزن کرديم ودر مايع بدست آمده حل نموديم تا اسي پروتئاز وپروتئين هاي همراه آن رسوب کنند.
    پس از حدود 2ساعت مخلوط واکنش درrpm4000 به مدت15 دقيقه سانتريفوژ شد
    ورسوب حاصل از آن جمع آوري شد.
    اين رسوب رادر پليت هاي 6 سانتي متري ريختيم ودر 30 درجه سانتي گراد انکوبه شد.
    براي سنجش فعاليت آنزيمي مقداري از رسوب هاي داخل پليت ها راکه بصورت کريستال درآمده اند در داخل محيط skim milkحل کرديم.


    فهرست منابع:

    تکنولوژي شيروفرآورده هاي لبني.انتشارات دانشگاه فردوسي مشهد.

    مفاخري س.1385.(ميکروبيولوژي صنعتي)

    .
    .
    جهان سوم جا نیست
    جهان سوم طرز تفکر ماست
    نه آن مرزهایی که داخلش زندگی می کنیم
Working...
X